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英文名称：West Nile DetectTM IgM Capture ELISA
【产品规格】96T
【预期用途】
华南生物工程有限公司试剂盒可用于定性检测人血清中的西尼罗病毒IgM抗体。
本实验用于临床实验室诊断临床上有与脑膜脑炎症状相一致的病人西尼罗病毒的感染。阳性的结果必需用蚀斑减少中和试验（PRNT）来证实，或者使用现有的CDC的的指南来确诊该疾病。
警告：一些西尼罗病毒IgM实验的测试样品中可能含有肠道病毒的抗体，应注意其交叉反应。
【前言简介】
感染西尼罗病毒可引起包括脑炎在内的一系列临床症状，西尼罗病毒（WNV）是一种潜在的嗜神经病毒，它可引起人群中无症状的感染或者是发热。人或动物的感染初在西半球并无证实，直到1999年在纽约爆发了该疾病，自此以后，该疾病扩散至美国的其他地方，到2003年，该疾病在46个国家发生，并且引起超过9800人发病，大多数西尼罗感染者无任何症状，小部份人可能发展为包括发热﹑头痛﹑身体疼痛﹑皮肤发疹﹑淋巴结肿大在内的轻微的临床症状，在临床上，人西尼罗病毒感染引起的发热是具有自限性的急性发热性疾病，伴头痛﹑肌肉酸痛﹑多发性关节痛﹑发疹﹑胃肠道症状和淋巴结炎。少于1％的感染者发展成严重的疾病，包括脑炎和脑膜炎。试剂盒使用了西尼罗的重组抗原（WNRA），它可以作为西尼罗病毒感染的快速血清学敏感指标。西尼罗重组抗原是由包含两个西尼罗抗原（由prM-E遗传因子编码）的一段序列构成。
【检测原理】
华南生物工程有限公司试剂盒是基于双夹心法原理。未知的样本与质控品加入到微孔（包被有抗人IgM）中进行温育，样本中的特异性抗体会结合到微孔板上。洗板之后分别加入西尼罗河病毒抗原（WNRA）和普通细胞抗原（NCA）进行反应。再次洗板后加入酶联物，用于检测所结合的抗原。第三次洗板后加入底物液，一段时间后加入终止液终止颜色反应，溶液变为黄色。450nm下测量OD值。结果中WNRA与NCA的比值ISR可用于结果的判定。
【试剂盒组成成分】
微孔板 12×8
包被有羊抗人IgM。
样本稀释液 1×25ml
即用型、–70℃环境下可稳定至效期结束。
阳性质控 1×50ul
–70℃环境下可稳定至效期结束。
阴性质控 1×50ul
–70℃环境下可稳定至效期结束。
西尼罗河病毒抗原（WNRA） 1×5ml
即用型、–70℃环境下可稳定至效期结束。
普通细胞抗原（NCA） 1×5ml
即用型、–70℃环境下可稳定至效期结束。
酶联物 1×9ml
即用型、2~8℃环境下可稳定至效期结束。
洗涤液 1×120ml
10倍浓缩。
EnWash 1×20ml
即用型、2~8℃环境下可稳定至效期结束。
底物液 1×12ml
即用型、2~8℃环境下可稳定至效期结束、避光保存。
终止液 1×9ml
即用型、2~8℃环境下可稳定至效期结束。
所需材料（未提供）
1. 酶标仪
2. 蒸馏水
3. 不含CO2的37℃温育箱
4. 洗板机
5. 试管
6. 移液器
7. 计时器
8. 封口膜
【样本要求】
华南生物工程有限公司试剂盒只能用于血清样本的检测。通过常规手段采集全血样本，允许血液凝集，离心分离血清样本。不要使用脂血、溶血样本。
采集后的血清可在2~8℃下保存48小时，-70℃下可保存30天。
【检测方法】
在使用前，将所有试剂和样品平衡至室温。
洗涤液配制
将120ml的浓缩洗涤液加上1080ml的蒸馏水，摇匀，至无任何沉淀，稀释好的洗涤液多可在室温下放置四个月。
检测步骤
阳性﹑阴性质控和未知的血清的应进行双份检测，本实验96孔可供22人使用。
1. 将待测血清和阴阳性质控用样本稀释液1：100稀释，至少使用4ul的血清或质控加上396ul的样品释稀液。
2. 每孔加入50ul的1/100的释稀血清和质控。（需分别与WMRA、NCA反应）
3. 用封板纸封板
4. 37℃下温育1小时。
5. 在温育后，每孔加入300ul的洗涤液，用自动洗板机洗板六次。
6. 按照下图所述，用多头的移液管在A-D行加入50ul的WNRA，在E-H行加入50ul的NCA。
|
1 |
2 |
3 |
4 |
|
|
A |
WNRA |
WNRA |
WNRA |
WNRA |
|
B |
WNRA |
WNRA |
WNRA |
WNRA |
|
C |
WNRA |
WNRA |
WNRA |
WNRA |
|
D |
WNRA |
WNRA |
WNRA |
WNRA |
|
E |
NCA |
NCA |
NCA |
NCA |
|
F |
NCA |
NCA |
NCA |
NCA |
|
G |
NCA |
NCA |
NCA |
NCA |
|
H |
NCA |
NCA |
NCA |
NCA |
7. 用封板纸封板
8. 37℃下温育1小时
9. 在温育后，每孔加入300ul的洗涤液，用自动洗板机洗板六次。
10. 用多头的移液管每孔加入50ul的即用的酶联物。
11. 用封板胶纸封板
12. 37℃下温育1小时
13. 在温育后，每孔加入300ul的洗涤液，用自动洗板机洗板六次。
14. 用多头的移液管每孔加入150ul的EnWash。
15. 不用封板，在室温下（20~25℃）温育5分钟。
16. 在温育后，每孔加入300ul的洗涤液，用自动洗板机洗板六次。
17. 用多头的移液管每孔加入75ul的底物液。
18. 不用封板，在室温下（20~25℃），避光放置10分钟。
19. 温育后，用多头的移液管每孔加入50ul的终止液，不用封板，在室温下（20~25℃）温育1分钟。
20. 用酶标仪在450nm处读取OD值。
【结果计算】
质量控制
每一试剂均包含阳性质控和阴性质控血清，在以下的说明表里给出了可接受的ISR值。阴性质控和阳性质控用于质控试剂，阳性质控不会保证实验临界值的精确性。任一质控的ISR值不符合说明书的标准，那么实验是无效的必须重做。如果实验是无效的，则病人的结果不能报告。
排除标准：
计算阴性质控的WNRA和NCA值：（OD）
|
WNRA |
NCA |
|
|
|
0.085 |
0.076 |
|
NO.2 |
0.075 |
0.060 |
|
总计 |
0.160 |
0.136 |
WNRA=0.160/2=0.080
NCA=0.136/2=0.668
ISR=0.0.080/0.068=1.18
任何阴性质控的ISR值高于4.47，则实验为无效的，需要重做。
计算阳性质控的WNRA和NCA值：(OD)
|
WNRA |
NCA |
|
|
|
0.935 |
0.090 |
|
NO.2 |
0.955 |
0.078 |
|
总计 |
1.890 |
0.168 |
WNRA=1.890/2=0.945
NCA=0.168/2=0.084
ISR=0.945/0.0.084=11.3
任何阳性质控的ISR值低于5.66，则实验是无效的，需要重做。
以下标准是必需遵守的，不满足以下标准，则表明试剂出现了质量问题或操作错误，实验需重做。
|
因素 |
范围 |
|
阴性质控OD均值 |
＜0.300 |
|
阳性质控OD均值 |
＞0.500 |
|
阳性质控的ISR值 |
＞5.66 |
|
阴性质控的ISR值 |
＜4.47 |
结果计算
计算测试血清的ISR值：
示例：
|
WNRA |
NCA |
|
|
|
0.195 |
0.066 |
|
NO.2 |
0.205 |
0.070 |
|
总计 |
0.400 |
0.136 |
WNRA=0.400/2=0.200
NCA=0.136/2=0.068
ISR=0.200/0.0.068=2.94
结果判定
ISR 小于4.47
阴性、未检测到IgM抗体。结果并无排除西尼罗病毒感染。假如怀疑早期感染，在7-14天内取另外的样品再进行检测，或者进行其他的实验来证实实际的感染。请参照现有的CDC指引条例来诊断该疾病。
ISR 4.47~5.66
可疑、可疑样品必须同样地重做。假如两个同样做的结果均高于或低于临界值，则各自报告为阳性或者阴性。在重复实验后，仍为可疑的样品也应报告为未检测到西尼罗病毒的IgM抗体，或者选择其他的方式重新实验或者重新采集样品。
ISR 大于5.66
阳性、存在有可检测的IgM抗体，推测有西尼罗病毒感染，结果需被PRNT实验证实。或者参照现有的CDC条例来诊断该疾病。IgM阳性的结果，并不表明有近期感染，西尼罗IgM抗体可持续存在500天，黄病毒科的交叉反应是常见的，另外还存在与肠道病毒的交叉反应，儿童阳性的结果应该包含一警告书，说明与肠道病毒存在交叉感染的可能性。
仅供科研使用
代理商企业：广州华南生物工程有限公司